วิเคราะห์ ในช่วงต้นทศวรรษที่ 90 ของศตวรรษที่ 20 มีการเสนอวิธีการใหม่โดยพื้นฐานในการวินิจฉัยโรคโดยใช้ PCR มีการคิดค้น PCR แบบเรียลไทม์ สาระสำคัญของวิธีการคือเนื่องจากการเติมฟลูออโรฟอร์ชนิดพิเศษลงในหลอดทดลอง ทำให้สามารถตรวจจับผลิตภัณฑ์ PCR ได้ตลอดการขยายสัญญาณทั้งหมด ฟลูออโรฟอร์ถูกรวมเข้ากับ DNA ที่มีเกลียวสองเส้นและได้รับความสามารถในการเรืองแสงซึ่งตรวจพบโดยอุปกรณ์ ยิ่งมีการสังเคราะห์ผลิตภัณฑ์ PCR มากเท่าใด

ก็จะยิ่งสังเกตเห็นการเรืองแสงที่เข้มข้นมากขึ้นเท่านั้น อีกวิธีหนึ่งคือการติดฟลูออโรฟอร์และสารดับฟลูออเรสเซนต์เข้ากับโอลิโกนิวคลีโอไทด์ หากเกิดการผสมพันธุ์ ฟลูออโรฟอร์จะถูกแยกออกจากตัวดับและบันทึกฟลูออเรสเซนซ์ PCR แบบเรียลไทม์ทำให้ไม่เพียงตรวจจับผลิตภัณฑ์ PCR ในระหว่างการขยายเท่านั้น แต่ยังกำหนดปริมาณและความเข้มข้นของ DNA เริ่มต้นได้ด้วย วิธีนี้ส่วนใหญ่ใช้เพื่อประเมินการแสดงออกของยีน

ในการทำเช่นนี้ RNA จะถูกแยกออกจากเนื้อเยื่อ ปฏิกิริยาการถอดความแบบย้อนกลับ การสังเคราะห์ cDNA จะดำเนินการ จากนั้นจึงทำ PCR แบบเรียลไทม์ เทคโนโลยีใหม่ช่วยให้การสังเคราะห์ cDNA และ PCR สามารถดำเนินการได้พร้อมกัน ในบรรดาข้อดี เราสามารถสังเกตความไวสูงของวิธีการ จำนวนเล็กน้อยของ RNA หรือ cDNA ที่ต้องการ การไม่มีความจำเป็นต้องดำเนินการอิเล็กโทรโฟรีซิสหลังปฏิกิริยา ความสามารถในการดำเนินการพร้อมกันหลายร้อยปฏิกิริยา

ในครั้งเดียว อุปกรณ์. ในบรรดาข้อบกพร่องของวิธีการ ควรสังเกตสิ่งต่อไปนี้ มันมีราคาแพงกว่า PCR ทั่วไปอย่างมาก ต้องการคุณภาพของเมทริกซ์ และอนุญาตให้ขยายเฉพาะชิ้นส่วน DNA ขนาดเล็กเท่านั้น โดยทั่วไปแล้ว PCR แบบเรียลไทม์จะค่อยๆ แทนที่ PCR แบบเดิม วันนี้วิธีนี้เป็นวิธีที่ใช้มากที่สุด กระบวนการ เอพิเจเนติก ได้รับความสำคัญอย่างมากในสาเหตุของโรคต่างๆ รวมถึงกรรมพันธุ์ โรคต่างๆ เช่น กลุ่มอาการพราเดอร์ วิลลี กลุ่มอาการแองเจิลแมน

กลุ่มอาการเบควิธ ไวเดอมันน์ มีความเกี่ยวข้องกับ เมทิลเลชั่น ที่บกพร่อง เมทิลเลชั่นที่บกพร่องยังเป็นเกณฑ์การวินิจฉัยสำหรับมะเร็งหลายชนิด ในเรื่องนี้ ได้มีการเสนอปฏิกิริยาเชิงคุณภาพเพื่อหาเมทิลเลชัน เมทิลสเปซิฟิก PCRสาระสำคัญของปฏิกิริยานี้มีดังนี้ DNA ได้รับการบำบัดด้วยโซเดียมไบซัลไฟต์ซึ่งเป็นผลมาจากการที่สารตกค้างไซโตซีนที่ไม่ได้รับเมทิลเลตทั้งหมดจะถูกเปลี่ยนเป็นยูราซิลและเมทิลเลตจะไม่เปลี่ยนแปลง หลังจากนั้น PCR

จะดำเนินการด้วยไพรเมอร์ที่สอดคล้องกับลำดับเมทิลเลตและไม่ได้เมทิลเลต ตามคู่ของไพรเมอร์แอมพลิฟายเออร์ที่เกิดขึ้น เราสามารถตัดสินเมทิลเลชันได้ ในบรรดาข้อบกพร่อง เราสามารถสังเกตเห็นความยากลำบากในการเลือกไพรเมอร์ การแปลงที่ไม่สมบูรณ์ และความเป็นไปได้ในการประเมินไดนิวคลีโอไทด์ CpG เพียงตัวเดียว อย่างไรก็ตาม วิธีการนี้ค่อนข้างถูก เฉพาะเจาะจง และเรียบง่าย ซึ่งช่วยให้สามารถใช้กันอย่างแพร่หลาย

ในการวินิจฉัยเนื้องอกร้ายและโรคประจำตัว ความไวและความจำเพาะของวิธีการวินิจฉัยโดยตรงอยู่ในระดับสูง วิธีการทั่วไปสามวิธี ได้แก่ การวิเคราะห์ข้อจำกัด PCR เฉพาะอัลลีล และ PCR ตามเวลาจริง ผู้ช่วยห้องปฏิบัติการหรือนักวิจัยในแต่ละกรณีจะหยุดที่วิธีการใดวิธีหนึ่ง จากนั้นจึงเปลี่ยนไปใช้วิธีอื่นได้ วิธีการทั้งหมดแม่นยำมาก พวกมันช่วยให้คุณระบุการกลายพันธุ์ของ DNA ได้อย่างชัดเจน แม้ว่าความแตกต่างนั้นจะเป็นเบสเดียวก็ตาม

วิธีการคัดกรองการกลายพันธุ์ หากไม่ทราบลักษณะของการกลายพันธุ์ และภาพทางคลินิกของโรคบ่งชี้ว่ายีนใดที่อาจเกิดการกลายพันธุ์ได้ วิธีการตรวจคัดกรองการกลายพันธุ์ต่อไปนี้จะใช้ในการวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการ ความไวของวิธีการตรวจคัดกรองเพื่อตรวจหาการกลายพันธุ์นั้นไม่แน่นอน อย่างไรก็ตาม อัตราส่วนระหว่างเนื้อหาข้อมูลและค่าใช้จ่ายค่อนข้างสูง ดังนั้นจึงมีการใช้กันอย่างแพร่หลายในทางปฏิบัติ ในเวลาเดียวกัน พลังลบของพวกเขามีขนาดเล็ก

หากตรวจไม่พบการเปลี่ยนแปลง ก็ไม่ได้หมายความว่าไม่มีอยู่จริง ลักษณะเฉพาะของวิธีการตรวจคัดกรองการกลายพันธุ์บางอย่างจะได้รับด้านล่าง SSCP ความแตกต่างของโครงสร้างเส้นเดี่ยว วิธีการวิเคราะห์ความหลากหลายทางโครงสร้างของ DNA สายเดี่ยว ขึ้นอยู่กับการบันทึกความแตกต่างในการเคลื่อนที่ด้วยไฟฟ้าของ DNA สายเดี่ยว ซึ่งมีขนาดเท่ากัน แต่แตกต่างกันเนื่องจากการแทนที่ของนิวคลีโอไทด์ใน การจัดระเบียบเชิงพื้นที่ของโมเลกุล

โครงสร้างของ DNA สายเดี่ยวขนาดเล็กขึ้นอยู่กับลำดับนิวคลีโอไทด์ ดังนั้น แม้แต่การแทนที่แบบสายเดี่ยว นิวคลีโอไทด์นำไปสู่การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างเชิงพื้นที่ วิธีการนี้รวมถึงการขยายชิ้นส่วน DNA ให้มีขนาดสูงถึง 300 คู่เบส การเสียสภาพธรรมชาติของผลิตภัณฑ์ PCR และเจลอิเล็กโตรโฟรีซิสโพลีอะคริลาไมด์ที่มีความละเอียดสูง วิธีการเชิงโครงสร้างสำหรับการตรวจจับการกลายพันธุ์ของจุดนั้นแพร่หลายเนื่องจากความเรียบง่าย

ความสามารถในการตรวจจับการแทนที่ประเภทใดก็ได้ ข้อจำกัดคือขนาดของชิ้นส่วน DNA ที่กำลังศึกษา เนื่องจากประสิทธิภาพการตรวจจับการกลายพันธุ์สูงที่ 80 ถึง 90 เปอร์เซ็นต์ จะแสดงสำหรับชิ้นส่วนที่มีคู่เบสน้อยกว่า 200 คู่ และสำหรับชิ้นส่วนที่มีคู่เบสมากกว่า 400 คู่ ความน่าจะเป็นของการตรวจหาการกลายพันธุ์จะลดลง ถึง 50 เปอร์เซ็นต์ ปัจจุบันความละเอียดของวิธีการได้เพิ่มขึ้นอย่างมาก โดยเฉพาะอย่างยิ่ง

วิธีการได้รับการพัฒนาสำหรับการระบุการกลายพันธุ์ของจุดโดยการวิเคราะห์ SSCP ในชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ขยายขนาดได้ถึง 800 คู่เบสในขนาด สำหรับสิ่งนี้ จะใช้เจลโพลีอะคริลาไมด์ที่มีค่า pH ต่ำ HA การวิเคราะห์แบบเฮเทอโรดูเพล็กซ์ วิเคราะห์ แบบเฮเทอโรดูเพล็กซ์ ช่วยให้สามารถตรวจจับการกลายพันธุ์ในสถานะเฮเทอโรไซกัส ตลอดจนการแทรกและการลบ หลักการของวิธีนี้มีดังนี้ ในระหว่างการขยายของชิ้นส่วนของยีนเฮเทอโรไซกัส

การเสียสภาพที่ตามมาและการคืนสภาพที่ช้าของผลิตภัณฑ์ PCR ที่เป็นผลลัพธ์ในส่วนผสมของการขยายพร้อมกับโฮโมดูเพล็กซ์สองประเภท เฮเทอโรดูเพล็กซ์จะเกิดขึ้นระหว่างสาย DNA ปกติและกลายพันธุ์ โมเลกุลเฮเทอโรดูเพล็กซ์ดังกล่าวแตกต่างกันในการเคลื่อนที่ด้วยไฟฟ้าจากโฮโมดูเพล็กซ์เนื่องจากลักษณะโครงสร้างที่ตำแหน่งของนิวคลีโอไทด์ที่ไม่ตรงกัน เนื่องจากการเคลื่อนที่ด้วยไฟฟ้าของเฮเทอโรดูเพล็กซ์นั้นต่ำกว่าของโฮโมดูเพล็กซ์มาก ความแตกต่างเหล่านี้ตรวจพบโดยอิเล็กโตรโฟรีซิสในเจลโพลีอะคริลาไมด์ทั่วไป

อ่านต่อได้ที่ >>    ผ่าตัด อธิบายการผ่าตัดเพิ่มขึ้นของขนาดหน้าอกสำหรับผู้หญิงที่มีอายุมาก